荧光显微系统质量评估应用分享第9期：”渐近线对”用于横向分辨率分析

Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。

本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成，有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请联系西诺光学，见文末联系方式。

以下内容将为大家分享Argolight荧光定量标准片中“渐近线对”图案用于分析系统的横向分辨率的案例。

“渐近线对”图案

图1：Argo-HM:“渐近线对”由十三对50μm长的有一定宽度的刻线组成，其间距以50nm为步进逐渐增加，间距从100 nm增加到700 nm。

图2：有四组不同方向的“渐近线对”

横向分辨率

横向分辨率是指显微镜以确定的对比度分辨彼此靠近的两个物体的能力。

问题：在任何荧光显微镜中，横向分辨率的降低都会导致样品图像的对比度损失。

由上述不同方向的“渐近线对”可以确认系统的横向分辨率。

实例：图3和4分别显示了用63×/1.4平场复消色差油物镜获得的垂直方向和45°方向的“渐近线对”的宽场显微镜图像。分别在DAPI通道和GFP通道。

在Argolight荧光定量标准片配套的软件Daybook中分析这些图像后， 得到垂直于“渐近线对”的强度分布，从中提取伪调制传递函数（MTF）。

从图3和4所示的伪MTF中，可以提取所选对比度（此处为15%）的横向分辨率。对于垂直方向的“渐近线对”，DAPI和GFP通道的分辨率分别为0.31和0.38μm，而对于45°方向的“渐近线对”，它们分别为0.34和0.36μm。

正如预期的那样，对于两种不同方向的线对，DAPI通道的分辨率都优于GFP通道。另外由于相机的像素阵列排列，同一通道下不同方向的分辨率也不同。

图3：Argo HM；（a，b）用63×/1.4平场复消色差油物镜在DAPI和GFP通道上获得的垂直“渐近线对”的宽场显微镜图像。（c，d）与原始图像中的ROI相关的强度分布。（e，f）MTF。定义对比度为15%时，DAPI和GFP通道的测量分辨率分别为0.31和0.38μm。正如所料，DAPI通道的分辨率优于GFP通道。

图4:Argo HM；（a，b）用63×/1.4平场复消色差油物镜在DAPI和GFP通道上获得的45°方向“渐近线对”的宽场显微镜图像。（c，d）与原始图像中的ROI相关的强度分布。（e，f）MTF。定义对比度为15%时，DAPI和GFP通道的测量分辨率分别为0.34和0.36μm。正如所料，DAPI通道的分辨率优于GFP通道。

横向分辨率与针孔尺寸的关系

问题：当针孔直径减小到1Airy以下时，荧光共聚焦显微镜可以提高相对于传统显微镜的横向分辨率。

使用“渐近线对”可以直接检测这种变化，从而验证理论预期。

实例：图5显示了不同针孔尺寸的横向分辨率的演变。当针孔直径从1减小到0.25 au时，横向分辨率从0.28减小到0.20μm。这与理论预期是一致的。

图5:Argo HM；（a） 在GFP通道上使用40×/1.3平面复消色差油物镜获得的水平“渐近线对”的共聚焦显微镜图像示例。不同针孔直径的MTF：（b）1Airy单位（au）、（c）0.75 au、（d）0.68 au、（e）0.5 au和（f）0.25 au。对于1、0.75、0.68、0.5和0.25 au针孔直径，定义对比度为15%的横向分辨率分别为0.28、0.24、0.23、0.21和0.20μm。正如预期的那样，分辨率随着针孔直径的增加而变差。

对比不同的成像方法

问题：在为特定生命科学应用选择成像方法的过程中，需要提前了解不同方法的分辨率情况。

“渐近线对”可用于比较传统图像去卷积与超分辨率显微镜的性能。

实例：图6显示了使用宽场显微镜获取的图像、去卷积图像和使用结构光照明的超分辨显微镜（SIM）获取的图像。

图6:Argo-SIM；（a） 宽场显微镜、（b）去卷积（c）结构光照明超分辨显微镜（SIM）下水平“渐近线对”的图像，用63×/1.4平场复消色差油物镜在GFP通道上获取。（d） 对于每种成像方法，垂直于线对的强度分布。正如预期的那样，比较表明SIM具有更好的分辨率。图像由索尔克生物研究所Waitt Advanced Biophotonics Core Facility的Uri Manor获取。

以上是本期关于系统的横向分辨率的分享，下周第10期将为大家分享更多其他图样的应用案例。请大家持续关注“sinoptix”微信公众号。