荧光显微系统质量评估应用分享第8期：光强响应分析以及相机性能对比

Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。

本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成，有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请联系西诺光学，见文末联系方式。

以下内容将为大家分享Argolight荧光定量标准片中“光强响应”图案用于分析系统的光强响应和对比相机性能的案例。

 

“4×4光强响应”图案

图1：例如Argo-HM v2.0中的“4×4光强响应”图案。该图案由16个8.5μm宽的正方形组成，在线性演化后具有不同的荧光强度级别，分布在4×4矩阵中。

 

“2×16光强响应”图案

图2：例如Argo-HM v2.0中的“2×16光强响应”图案。该图案由两组16个22.5μm×1.5μm的矩形组成，这些矩形在线性演化后具有不同的荧光强度级别，分布在2×16矩阵中。

 

01 光强响应

荧光显微镜的光强响应将输出的数字信号表示为输入的光子通量。在任何荧光显微镜中，整体强度响应可能随时间而变化。例如，照明功率、探测器灵敏度、光学对准等的变化可能导致强度响应波动。因此，当在不同时间获取的生物样本图像中进行强度量化时，强度响应就非常重要。

“光强响应”分析提供了成像系统对16个强度级别的强度响应，以及定量参数，如强度值和动态范围。监测这些参数可以观察强度响应相对于参考值随时间的演变。

以上两种强度分级模式具有相同的功能。根据显微镜的照明不均匀性，可以选择使用其中一种。

图3:Argo HM；（a） 用63×/1.4平场复消色差油物镜在GFP通道上获得的4×4光强响应图案的宽场显微镜图像。（b） 从每个小方形的ROI中提取平均强度。（c） 非归一化（左轴）和归一化（右轴）每个小方形ROI的平均强度，并给出了线性回归线及其方程和皮尔逊拟合系数。

问题：强度响应降低可能反映以下不同的问题：

 

· 在光路中插入了偏振片。如果在相同的采集参数下，新采集的图像的强度大约比通常低两倍，则可以确定这一点。
· 在光路中插入了DIC（微分干涉对比）组件。如果在相同的采集参数下，新采集的图像的强度比通常低10%左右，则可以确定这一点。
· 传感器灵敏度下降，通常是由于老化或过度曝光造成的。如果系统配备了多个传感器，则可以使用另一个传感器来识别，一般是共聚焦显微镜出现这种情况。
· 光源功率的下降或光纤导光率的下降，通常是由于老化引起的。如果可能的话，可以在物镜前后使用功率计测量每个光源的功率来鉴别。如果所有安装的光源光功率都下降，则应检查光路的耦合/对准。
· 荧光滤光片的透过率下降，通常是由于老化。这可以通过测量滤光片的透射光谱来检查。（推荐手持光谱仪，具体可咨询西诺光学）

实例：图4显示了分别在5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%激光功率下成像的4×4光强响应图案。以及每种激光功率下1-16级方形的平均强度和其相关线性回归线。

虽然对于5%、10%、15%和20%的激光功率，线性回归线的斜率不断增加，但对于25%、30%和35%的激光功率，线性回归线几乎重叠。

这往往表明激光功率调节存在故障，饱和超过20%。应使用光功率计进行补充测量，来验证这一故障。

这个典型的例子说明了一个事实，即当检测到强度响应存在问题时，必须使用功率计来识别和区分问题的根源：系统的照明路径（激光功率和耦合、滤波片透过率、AOTF等）或成像路径（传感器灵敏度、滤波片透过率等）。

图4: 分别在5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%激光功率下成像的4×4光强响应图案的1-16级方形的平均强度和其相关线性回归线。

注：由于照明的不均匀性，图中线性回归线周围的实测点波动是正常的。具体的线性演化方式可以咨询西诺光学。

 

02 光强响应随时间的演变

问题：荧光显微镜的整体强度响应可能会随时间而变化，尤其是在共聚焦显微镜和配备金属卤化物灯的宽场显微镜上。

 

实例：Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research (Basel, Switzerland)的研究人员使用Argo-HM对配备金属卤化物灯的宽场荧光显微镜的光强响应进行了近五个月的监测（见图5）。

研究团队测量到了±15%的波动，清楚地说明了设备的光强响应的变化。可能来自其照明组件（光源、滤光片）或其成像组件（相机、滤光片）。

最有可能的原因是金属卤化物灯的输出功率随时间而波动[1]。

由于结构的复杂性，激光扫描显微镜的强度波动可以达到相同的数量级。

对于希望进行长周期研究的细胞或发育生物学家来说，如果要使用图像的强度信息，则有必要根据系统的强度响应对其进行归一化。

图5：（a）来自宽场显微镜的4×4光强响应图像[ZEISS Axio Imager Z1, 平场复消色差干物镜 20×/0.8, 滤光片组 #10 (Exc: 450–490 nm, BS: 495 nm, Em: 500-550 nm), 金属卤化物 X-Cite 120 照明, 12月10日前使用相机Axiocam MRm, 然后从12月17日使用Axiocam 506]。（b） 在每次测量应用相同设置的情况下，第16级方形的强度随时间的演变。从12月10日到12月17日的跳跃对应于相机的变化。（b）图片由Ivana Horvathova and Laurent Gelman at the Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research获得。

 

03 对比相机性能

选择不同的应用于生命科学的相机取决于其性能：速度、灵敏度、线性、噪声等。

4×4和2×16光强响应均可用于比较不同传感器（CCD、CMOS和EMCCD）的性能。例如线性范围、灵敏度、饱和阈值、信噪比等。

 [1] T. R. Baird, D. Kaufman, and C. M. Brown, “Mercury free microscopy: An opportunity for core facility directors,” Journal of Biomolecular Techniques 25, 48-53 (2014).

 

以上是本期关于系统的光强响应以及对比相机性能的分享，下周第9期将为大家分享“渐近线对”图案用于分析横向分辨率的案例。请大家持续关注“Sinoptix”微信公众号。