荧光显微系统质量评估应用分享第7期：对比分析不同物镜性能

Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。

本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成，有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请联系西诺光学，见文末联系方式。

以下内容将为大家详细介绍Argolight荧光定量标准片中“二维点阵”图案用于对比分析不同物镜性能的案例。

矩形“二维点阵”图案（Argo-LM v2.0、Argo-HM v2.0、Argo-SIM v2.0）

图1：例如Argo-SIM v2.0中的“二维点阵”图案（超分辨率显微镜实拍图）。由21×21个小圆环组成的矩阵。每个圆环间5μm间隔，总面积为100μm×100μm。矩阵由八个定位标包围，中心有一个3μm长的十字。

比较物镜的性能

在具有相同放大倍率的多个显微镜物镜中，许多参数以及性能会影响我们的选择。除了数值孔径外，光学像差的校正也很重要。

表1列举了不同物镜对于3种光学像差的校正能力[1]。

表1：不同光学像差的物镜校正

本次案例将使用以下三种10×干镜进行测试，分别是：

• Plan-Semi-Apochromatic

平场半复消色差10×/0.3

• Plan-Apochromatic

平场复消色差10×/0.45

• Achromatic

消色差10×/0.5

表2显示了制造商网站提供的这些物镜的性能

注：本案例仅涉及使用的三个物镜，结论不能必然地推广至该类型的所有物镜。

表2：制造商网站提供的本次测试使用的三款物镜的性能。星号数量表示该性能的评级

使用安装在同一宽场显微镜上的这三个物镜对“二维点阵”进行了两个通道下的成像，分别是DAPI通道和GFP通道。（见图2）。

通过使用荧光定量标准片配套的图像分析软件Daybook对这些图像进行处理，评估了照明均匀性、视场畸变以及色差校正性能。

图2:Argo LM；对于DAPI和GFP通道，使用三种不同的10×干镜（a、b）平场半复消色差、（c、d）平场复消色差和（e、f）消色差 获得“二维点阵”图案的宽场显微镜图像。

1 照明均匀性对比

实例 图3和4显示了三个物镜(DAPI和GFP通道)的归一化均匀性heatmap和相关强度分布图。与均匀性相关的参数集合在表3中。

从这些图表中可以观察到，对于平场复消色差物镜和消色差物镜，最大照度更好地集中在视场中心。然而，平场半复消色差物镜呈现出最低的衰减值（Roll-off value）*。

从照明均匀性来看，如果只考虑衰减值（Roll-off value），则三个物镜可以由好到坏排序为:

Plan-Semi-Apochromatic、

Plan-Apochromatic、

Achromatic。

*衰减值（Roll-off value）:均匀荧光样品图像中最大和最小归一化强度值之间的差值。

  

图3:三种不同的10×干镜的归一化均匀性heatmap，(a, b)平场半复消色差，(c, d)平场复消色差，(e, f)消色差，对于DAPI和GFP通道。heatmap中的十字叉对应着强度的最大值和最小值。

图4:三种不同的10×干镜，(a, b)平场半复消色差，(c, d)平场复消色差，和(e, f)消色差，DAPI和GFP通道，沿着通过最大和最小强度的线(绿色线)和沿着热图的对角线(紫色和粉色虚线)。

表3:三种不同的10×干镜、DAPI和GFP通道照明均匀性相关参数。有关这些参数的含义和计算的更多信息，请咨询西诺光学。

2 视场畸变对比

实例 图5显示了三个物镜、DAPI和GFP通道的畸变heatmap。与视场畸变相关的参数见表4。

从图表中可以看出，平场半复消色差物镜呈现出最低的畸变率。

在视场畸变方面，如果只考虑畸变率，则可以将三个物镜由好到坏排序为:

Plan-Semi-Apochromatic、

Plan-Apochromatic、

Achromatic。

 

图5:DAPI和GFP通道的三种不同10×干镜(a, b)平场半复消色差，(c, d)平场复消色差和(e, f)消色差畸变的大小和方向heatmap。

表4:三种不同10×干镜、DAPI和GFP通道视场畸变相关参数。有关这些参数的含义和计算的更多信息，请咨询西诺光学。

3 色差校正

实例 图6显示了三个物镜DAPI相对于GFP通道的色差heatmap。与色差相关的参数见表5。

从图表中可以观察到，平场复消色差物镜呈现最低的色差。在色差校正方面，如果只考虑最大偏移量，那么这三个物镜就可以由好到坏排序为:

Plan- apochromatic、

Plan Semi-Apochromatic、

Achromatic。

 

图6:三种不同的10×干镜，(a)平场半复消色差，(b)平场复消色差，和(c)消色差，DAPI相对于GFP通道的色移的大小和方向heatmap。

表5:三种不同10×干镜、DAPI和GFP通道色差相关参数。有关这些参数的含义和计算的更多信息，请咨询西诺光学。

总结

使用”二维点阵“图案可以比较排序三个10×干镜的照明均匀性，视场畸变和色差校正的性能。

对于实验中被测物镜，我们发现价格最贵的平场复消色差物镜仅在色差校正性能上优于其他物镜。如果其他性能比如照明均匀性以及视场畸变对用户也很重要，并且用户可以降低对色差校正的期望，那么更便宜的平场半复消色差物镜是最适合的。

其他的性能，如物镜的PSF，横向轴向分辨率，对比度等都可以加入比较。这些性能会改变物镜排名，从而使用户重新考虑来选择更加适用且性价比高的物镜。

[1] http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/objectives.html

以上是本期关于对比分析不同物镜性能的分享，下周第8期将为大家解锁新的图案——“4×4 和 2×16光强响应”图案。请大家持续关注“Sinoptix”微信公众号。