荧光显微系统质量评估应用分享第6期：横向和轴向色差分析

2023-08-21

Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。

本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成，有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请联系西诺光学，见文末联系方式。

以下内容将为大家详细介绍Argolight荧光定量标准片中“二维点阵”图案用于横向和轴向色差分析的案例。

矩形“二维点阵”图案（Argo-LM v2.0、Argo-HM v2.0、Argo-SIM v2.0）

图1：例如Argo-SIM v2.0中的“二维点阵”图案（超分辨率显微镜实拍图）。由21×21个小圆环组成的矩阵。每个圆环间5μm间隔，总面积为100μm×100μm。矩阵由八个定位标包围，中心有一个3μm长的十字。

图2：Argo HM；使用40×/1.3平面复消色差油物镜，对（a）DAPI、（b）GFP、（c）Texas Red和（d）Cy5通道进行共聚焦显微镜成像。图像经过放大。

问题在任何荧光显微镜中，当要使用图像中的颜色信息时，了解横向和轴向的色差是很重要的。特别是对于带有多个染色标签的生物样本图像的共定位测试，需要了解不同通道之间的偏移并进行补偿，以防误判。

显微镜可以在一定程度上校正色差。例如，物镜和其他光学元件都有复消色差类型。根据显微镜制造商的解释，复消色差意味着对于4-5种不同的颜色，其横向和轴向的色差必须小于最高波长的系统分辨率[1]。

对于针孔直径≥1 Airy单元的共聚焦显微镜，点扩散函数(PSF)的横向和轴向半高全宽FWHM理论值由以下公式[2]给出:

其中n为浸没介质的折射率，NA为物镜数值孔径，λ为激发波长。因此，对于配备了40×/1.3 Plan-Apochromat油物镜的共聚焦显微镜，在405nm、488nm、552nm和638 nm的激发光和折射率为1.518的浸没介质下，PSF的横向和轴向理论FWHM如表1所示。

如果实际的横向色差比理论的横向FWHM值高，那么说明消色差校正就不在规范范围内。

表1：不同激发波长下点扩展函数（PSF）的理论横向和轴向FWHM

实例从图2所示的“二维点阵”图像中，Daybook可以提取有关横向色差的信息。

图3、4和5显示了不同通道对比下的色差heatmap。这些heatmap允许通过矢量确定色差的方向和大小，从中可以提取许多参数(参见表2)。

从表2可以看出，所有的通道的横向色差都比理论的PSF横向FWHM高。因此，在本例中，消色差校正不在规范范围内。

图3 (a, c) XY平面的“二维点阵”共聚焦显微镜图像的叠加，绿色为GFP通道，红色为DAPI通道。(b, d)色差对应的幅值和方向heatmap。(c)和(d)是(a)和(b)左下角的放大。

图4: XY平面的“二维点阵”共聚焦显微镜图像的叠加，绿色为GFP通道，红色为Texas Red通道。(b, d)色差对应的幅值和方向heatmap。(c)和(d)是(a)和(b)左下角的放大。

图5 (a, c) XY平面的“二维点阵”共聚焦显微镜图像的叠加，绿色为GFP通道，红色为Cy5通道。(b, d)色差对应的幅值和方向heatmap。(c)和(d)是(a)和(b)左下角的放大。

表2:DAPI, GFP, Texas Red和Cy5通道的色差相关参数。有关这些参数的含义和计算的更多信息，请咨询西诺光学。

实例由色差引起的轴向偏移可以按照与横向偏移相同的原理来确定，如图6 (DAPI和GFP通道的XY和XZ平面上“二维点阵”的宽场图像)。，

图6:Argo-SIM;用63×/1.4 Plan-Apochromat油物镜获得的DAPI(绿色)和GFP(红色)通道的(a) XY和(b) XZ平面“二维点阵”的宽场显微镜图像的叠加。(c)和(d)是(a)和(b)的放大。这些图像在横向和轴向显示了清晰的色差变化，证明消色差校正不在规范范围内。

[2] H. Beyer, “Handbuch der mikroskopie,” 2nd Edition, VEB Verlag Technik Berlin (1985).

以上是本期关于横向和轴向色差分析的分享，下周第7期将为大家继续分享“二维点阵”图案用于对比分析不同物镜性能的案例。请大家持续关注“Sinoptix”微信公众号。

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