荧光显微系统质量评估应用分享第5期：场畸变和线扩散函数
2023-08-22
Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。
本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成，有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请联系西诺光学，见文末联系方式。
以下内容将为大家详细介绍Argolight荧光定量标准片中“二维点阵”图案用于场畸变和线扩散函数的分析。
矩形“二维点阵”图案（Argo-LM v2.0、Argo-HM v2.0、Argo-SIM v2.0）
图1：例如Argo-SIM v2.0中的“二维点阵”图案（超分辨率显微镜实拍图）。由21×21个小圆环组成的矩阵。每个圆环间5μm间隔，总面积为100μm×100μm。矩阵由八个定位标包围，中心有一个3μm长的十字。
图2：Argo HM；使用40×/1.3平面复消色差油物镜，对（a）DAPI、（b）GFP、（c）Texas Red和（d）Cy5通道进行共聚焦显微镜成像。图像经过放大。
场畸变
场畸变可以定义为视场的变形，通常出现在图像的角落。
问题 在任何荧光显微镜中，当要测量图像中的空间信息（如距离）时，了解设备视场畸变的情况就很重要。对于生物样本图像中的位置、长度、面积或体积量化，应了解并且最终校正场畸变，才能获得准确的测量结果。
显微镜物镜的制造商一般不提供物镜的畸变率（DR）。
根据经验，畸变对图像质量产生的影响程度如下：
- 如果DR<0.3%，影响可忽略不计，
- 如果0.3%<dr<0.4%，< span=””>影响较小， </dr<0.4%，<>
- 如果0.5%<dr<0.6%，< span=””>可接受， </dr<0.6%，<>
- 如果0.7%<dr<0.9%，< span=””>影响较大， </dr<0.9%，<>
- 如果DR>1%，难以接受。
实例 从图2所示的“二维点阵”图像中，Daybook可以提取有关视场畸变的信息，以畸变热图（heatmap）的形式表示，参见图3。
这些热图允许通过向量确定畸变的方向和幅度，从中可以提取许多参数，参见表1。
表1显示，对于所有通道，沿X轴的畸变率小于0.2%，而沿Y轴的畸变率小于0.4%。
图3：（a）DAPI、（b）GFP、（c）Texas Red和（d）Cy5四个通道畸变的方向和幅度热图。
表1：与DAPI、GFP、Texas Red和Cy5通道畸变相关的一些参数。有关这些参数的含义和计算的更多信息，请咨询西诺光学。
线扩散函数
线扩散函数这项测试可以提供有关光从线状图案进行强度扩散的方式和程度的信息。线的强度扩散可以用高斯函数建模，其中半高全宽（FWHM）表示扩散行为。
“二维点阵”中的十字可以用来提取垂直和水平方向上的线扩散函数。
问题 一个对齐良好的显微镜的任何通道，都应在垂直和水平方向上呈现对称的FWHM。此外，FWHM应随激发波长的增加而增加，即DAPI通道的FWHM应低于Cy5通道的FWHM。
实例 图4是“二维点阵”中的十字在不同通道的图像。在图5中，为每个通道绘制了垂直和水平两个方向的强度线轮廓。使用双高斯函数来拟合线轮廓。其垂直和水平FWHM如表2所示。
结果表明，对于所有通道，高斯分布在垂直方向上的FWHMs均大于水平方向上的FWHMs。此外，GFP通道的FWHM最低，Texas red通道的FWHM最大。
这两个观察结果都表明，显微镜没有很好地对齐。
图4：Argo HM；使用40×/1.3平面复消色差油物镜，对（a）DAPI、（b）GFP、（c）Texas Red和（d）Cy5通道，进行 “二维点阵”的共聚焦显微镜成像。然后进行放大，截取“十字“图像。
图5：（a，b）DAPI、（c，d）GFP、（e，f）Texas Red和（g，h）Cy5通道沿垂直和水平方向的强度剖面图。采用双高斯函数拟合线轮廓。
表2:DAPI、GFP、Texas Red和Cy5通道在垂直和水平方向上拟合函数的均方根值和半高宽。完美拟合的RMS值为0。有关这些参数的含义和计算的更多信息，请咨询西诺光学。
以上是本期关于场畸变和线扩散函数的分享，下周第6期将为大家继续分享“二维点阵”图案的用于横向和轴向色差的分析案例。请大家持续关注“Sinoptix”微信公众号。
