荧光显微系统质量评估应用分享第1期：验证系统的视场大小和齐焦性

Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。

本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成，有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请咨询西诺光学，联系方式见文末。

 环形“目标靶”图案

图1：例如Argo-SIM v2.0中的“目标靶”图案。由同心圆组成，半径从10μm增加到120μm，10μm为一个步进。

1.空间尺度（视场大小）

问题 在大多数显微镜中，视场大小在理论上取决于物镜和其他透镜的放大倍率、相机芯片尺寸（对于有相机的系统）和变焦放大率（对于激光扫描系统）。

由于以上这些参数可能存在误差并不准确，所以视场的实际尺寸可能与理论尺寸不符。可以使用已知尺寸的图案检查视场的实际大小。

实例 图2显示了“目标靶”的共聚焦显微镜图像，带有测量同心圆直径的标尺，可以检查视场理论尺寸的正确性。

图2:Argo HM；“目标靶”的共聚焦显微镜图像。用标尺测量同心圆的直径，以检查视场理论尺寸的正确性。

2.齐焦性和中心对齐

问题 齐焦性和中心对齐是当物镜切换时，系统分别保持目标在同一焦点处和同一横向位置的能力。

对系统部件（物镜、位移台、滤光器等）的微调可以补偿齐焦性和中心对齐的缺陷，从而允许在不重新调整仪器的情况下自由切换物镜。在大多数显微镜中，中心对齐不能被校正。齐焦性可以通过重新调整Z轴位置来补偿，以便样品处于焦点位置。

齐焦性和中心对齐应该在安装或维护显微镜时，由经验丰富的技术人员进行调节补偿。

补偿不同物镜之间的齐焦缺陷步骤：

•  使用具有最高数值孔径的干物镜定义参考焦点
•  从高数值孔径切换到低数值孔径。使用Z-stage为每个物镜补偿焦距差异
•  在样品上滴一滴浸润介质后，切换至浸液物镜。使用Z-stage补偿焦距差异

注意：执行此步骤时，请勿触摸或更改样品位置。

实例 图3显示了用三种不同物镜获得的“目标靶”的宽场显微镜图像，证明存在齐焦度和中心对齐的缺陷。可由技术人员进行调节补偿。

图3:Argo HM；在同一旋转台上，使用三种不同的平面复消色差物镜（a）40×/0.95干物镜，（b）20×/0.8干物镜 和（c）63×/1.4油镜 在GFP通道上拍摄“目标靶”的宽场显微镜图像。平面复消色差40×/0.95干物镜为参考物镜。

以上是本期分享的两例应用，下周第2期将为大家分享“目标靶”图案用于系统相机对齐，以及验证系统图像缝合能力的案例。请大家持续关注“sinoptix”微信公众号。