荧光显微系统质量评估应用分享第11期：Z-stage漂移检测以及物镜轴向像差检测

2023-08-10

Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。

本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成，有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请联系西诺光学，见文末联系方式。

以下内容将为大家分享Argolight荧光定量标准片中“3D交叉楼梯”用于Z-stage漂移的检测以及物镜轴向像差的检测案例。

“3D交叉楼梯”图案

图1 ：Argo-SIM: 0.25μm步长“3D交叉楼梯”该图案由两个11个不同深度的空圆柱体组成，看起来像两个交叉的楼梯，四周有四根柱子。楼梯的步长为：0.25μm。

图2 ：Argo-SIM: “3D交叉楼梯”的示意图，总共有4组不同步长的交叉楼梯，单位均为μm。

3D重构精度

问题：相对于上周分享中提到的“3D球径”图案来说，“3D交叉楼梯”可用于评估激光扫描显微镜的光学切片和Z-stacking能力，如图3所示。

因此，在三维重构后，可以容易地识别Z-stacking期间的任何漂移。

图3：Argo-HM；对在GFP通道上用63×/1.4平场复消色差油物镜采集的共聚焦显微镜图像的Z-stack进行“3D交叉楼梯”的三维重构。

Z-stage漂移检测

问题：荧光显微镜周围的环境条件会影响其性能。如果特定的实验需要高分辨率或者高精度，那么环境条件的影响不容忽视。特别是显微镜载物台的轴向漂移对温度和气流波动非常敏感。

在长周期成像期间一般很难意识到会有多少漂移。通常需要获取多个Z-stacks才能了解Z-stage漂移。

通过采集包含3D信息的2D图像，来测量该参数。

实例：图4显示了0.75μm步长的“3D交叉楼梯”的二维图像。最初是在楼梯中间点所在的深度进行聚焦。在后续一段时间内可以观察到连续漂移，最终漂移了4级（即4×0.75μm=3μm）。

图4：Argo-HM；（a-d）0.75μm步长的“3D交叉楼梯”的二维共聚焦显微镜图像，以不同时间间隔在GFP通道使用63×/1.4平场复消色差油物镜获取的。聚焦平面在一段时间后发生漂移，箭头指示聚焦中的初始楼梯位置即证明了这一点。

物镜的轴向像差

问题：光学像差例如像散或球差，可通过获取荧光小球或任何具有足够小轴向延伸的荧光物体的XY平面中的荧光显微镜Z-stack图像来识别。

这两种像差的特征在轴向上更加明显。可以用荧光显微镜获取荧光定量标准片中的“3D交叉楼梯”的图像来检验。楼梯台阶位于玻璃内部固定的深度，所以包含了已知的3D信息。失焦台阶的光扩散取决于物镜质量和显微镜的对准。

非圆扩散是像散的特征，而焦平面两侧的不对称扩散是球差的典型特征。

实例：图5显示了“3D交叉楼梯”不同GAMMA值的共聚焦图像。它们的针孔直径为1Airy。

对于无像散的物镜，图像显示圆形光扩散。对于出现某些像散的物镜，图像显示像散的非圆（椭圆形）扩散特征。当GAMMA参数设置为0.45时，效果看起来更明显。

同样的方法可用于识别球差、物镜损坏或光路中是否存在DIC组件等。

图5：Argo-HM；0.75μm步长的“3D交叉楼梯”的二维共聚焦显微镜图像，在GFP通道上获得，具有两个相同型号的63×/1.4平场复消色差油物镜，（a，b）物镜呈现一些像散，（c，d）物镜不呈现像散。像散由失焦楼梯台阶传播的非圆光证明。当GAMMA参数设置为0.45时，这种效应看起来更明显。图像由Laurent Gelman at the Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research.采集。

以上是本期关于“3D交叉楼梯”用于Z-stage漂移的检测以及物镜轴向像差的检测案例的分享，下周第12期将为大家分享更多其他图样的应用案例。请大家持续关注“Sinoptix”微信公众号。