荧光显微系统质量评估应用分享第10期：轴向分辨率、3D重构性能以及Z轴距离检测分析

Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。

本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成，有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请联系西诺光学，见文末联系方式。

以下内容将为大家分享Argolight荧光定量标准片中“轴向步进十字叉”和“3D球径”图案分别用于轴向分辨率和3D重构、Z轴距离检测的分析案例。

 

“轴向步进十字叉”图案（Argo-HM v2.0，-SIM v2.0）

图1 ：Argo-SIM:“轴向步进十字叉”该图案由4×4十字叉矩阵组成，长度为5μm，间隔为10μm，周围有一个40μm长的框架。十字叉由同一平面内的垂直线和水平线组成。垂直线和水平线之间的间距逐渐增加，从0.1μm增加到1.6μm，步进为0.1μm。

 

“3D球径”图案（Argo-HM v2.0，-SIM v2.0）

图2：Argo-HM:“3D球径”该图案由三个直径为50μm的圆在不同的正交平面上组成，以一个球体的赤道和两条子午线为特征。

轴向分辨率

轴向分辨率是显微镜以规定的对比度分辨两个彼此重叠的物体的能力。

问题：在任何荧光显微镜中，轴向分辨率的降低都会导致样品图像的对比度损失。许多方面的原因都会影响轴向分辨率。比如：

•  在光路中插入DIC组件，
•  显微镜物镜上的污渍，
•  显微镜物镜的损坏，
•  使用折射率不合适的浸没介质，引入额外的球面像差。

实例：矩阵中的十字叉由同一XY平面中的垂直线和越来越深的水平线组成。根据用户定义的对比度，可以测量形成单个十字叉的水平线和垂直线之间的距离。如图3所示。

  

图3：Argo-SIM；通过结构照明显微镜在GFP通道上使用63×/1.4复消色差油物镜获得的“轴向步进十字叉”图案的（a）3D重构和（b，c）2D montages。图像由哈佛医学院细胞生物学显微镜平台的Talley Lambert采集。

 

3D重构精度

问题：激光扫描显微镜的最大优点之一是能够通过过滤失焦光获取样品的图像切片，从而使其重构和可视化成为可能。

因此，评估这种显微镜的光学切片和Z-stacking能力非常重要。

具有已知形状和尺寸的3D荧光图案 ”3D球径” 就非常适合用来评估显微镜的这些性能。对“3D球径”图案进行重构后，可以容易地识别Z-stacking时发生的漂移。

实例：图4显示了从共聚焦显微镜的Z-stack图像中精确重构的“3D球径”的三维图。

图4:Argo HM；在GFP通道上使用63×/1.4平场复消色差油物镜获得的“3D球径”的共聚焦显微镜Z-stack图像的3D重构示例。

 

Z轴距离检测

问题：荧光显微镜采集软件显示的Z轴距离可能不准确，因为它们取决于Z-stage的精度，以及样品和浸没介质的折射率。

Argo HM中“3D球径”由3个直径为50μm的圆组成，位于XY、XZ和YZ平面上。

通过测量XZ和YZ平面中圆的直径，可以检查显微镜采集软件提供的Z轴距离是否准确。

实例：图5显示了共聚焦显微镜Z-stack图像中“3D球径”在XY、YZ和XZ平面上的视图。测得的球体在Z轴方向直径为49.9μm，与已知的50μm一致。

图5: Argo HM；分别是“3D球径”在（a） XY、（b）YZ和（c）XZ平面上的正交视图，该视图来自使用63×/1.4平场复消色差油物镜在GFP通道上获取的共聚焦显微镜Z-stack图像。（d） 整个堆栈的平均强度与Z轴距离的关系。正交视图中的红色圆是完美的圆，用作参考。

 

在本实验中，使用了油物镜。当使用干物镜时，Z轴方向上球体直径的测量值会减少一个与玻璃和空气之间的折射率差相对应的数值。因此，需要进行校正，以恢复球体轴向直径的实际值。大多数显微镜采集软件都包含这项功能。也可以用这个图案来进行验证。

 

以上是本期关于系统的轴向分辨率，3D重构精度以及Z轴距离检测的分享，下周第11期将为大家分享更多其他图样的应用案例。请大家持续关注“sinoptix”微信公众号。