荧光显微系统质量评估应用分享第12期：重定位精度以及伪影观察

2023-07-24

Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。

本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成，有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请联系西诺光学，见文末联系方式。

以下内容将为大家分享Argolight荧光定量标准片中“定位十字叉”用于重定位精度，以及“几何图案”用于伪影观察的案例分享。

“定位十字叉”图案

图1：Argo-SIM:“定位十字叉”长度为20μm

“几何”图案（Argo-SIM v2.0）

图2：Argo-SIM:中的各种几何图案

重定位精度

问题：载物台的重定位精度对于图像拼接非常重要。厂家一般会提供与载物台相关的重定位误差。

我们可通过以下方式轻松检查：

将包含已知信息的对象置于视野中心（例如“定位十字叉”），
在不同方向上来回移动样品，
每次样本返回其初始位置时获取图像。

叠加图像并在每个图像中检测观察对象的质心，确定空间偏移，然后检查偏移是否在规范范围内。

实例：图3显示了载物台在X和Y方向上来回移动后返回初始位置的“定位十字叉”的图像叠加。

可以观察到，载物台的重定位精度要比厂家提供的5μm精度大很多。

图3：（a）X和Y方向上往返后“定位十字叉”的图像叠加。（b）系统的重定位精度在精度范围靶面上的位置，可以跟厂家给出的值5μm作对比，显示实验真实的精度。

物镜检测

问题：物镜前透镜上的灰尘和干掉的油渍，以及其他损坏例如划痕会明显改变图像质量。

因此，建议在开始任何成像实验之前，先检查物镜是否存在此类问题。

该检查的一种简单而快速的方法是通过目镜观察“定位十字叉”。当然，此类检查取决于用户的体验，在使用Argolight荧光定量标准片一段时间后，可能会很快发现这些问题。

实例：图4显示了“定位十字叉”的Z-stack的XY和XZ正交视图。63×/1.4平场复消色差油物镜的前透镜上有污渍（干掉的油渍或灰尘），之后进行了清洁。

通过模糊的XY图像和Z轴方向的扩散来证明污渍的存在。这个简单的测试可以提供有关物镜清洁度的信息。

图4：Argo-HM；（a，c）XY和（b，d）XZ视图，来自使用63×/1.4平场复消色差油物镜获取的共聚焦显微镜图像的Z-stack，（a，b）前透镜上有污渍，（c，d）清洁污渍之后。污渍的存在通过更模糊的XY图像和Z轴更大的扩散来证明。图片由Friedrich Miescher生物医学研究所的Laurent Gelman拍摄。

伪影观察

问题：一些成像技术，如结构照明超分辨显微镜（SIM），需要使用专门的算法从一组原始图像中获得重建的超分辨率图像。

然而，根据原始图像的信噪比，这些专用算法可能会在重建图像中引入伪影[1]。

“几何图形”允许评估SIM重建算法的精度，并观察它们可能引入的伪影。

实例：图5显示了用SIM采集的16臂星和七边形的归一化图像。

从16臂星的两臂之间以及七边形内部的重建中可以观察到清晰的伪影。