对照ISO标准，显微镜PSF测试的每个细节你都做对了吗？
2023-08-22
欢迎您来到由法国Argolight组织的显微镜PSF测试系列活动的收官活动。Argolight在Daybook软件新增PSF 测试的筹备过程中，就寻求了相关测试标准来进行参考，希望所有用户利用他们的Daybook软件，都能获得符合这些标准的PSF测试结果。这一弹活动中，我们将：
1）了解与共焦显微镜相关的一套标准ISO 21073，
2）解读该标准中与PSF测试有关的内容，
3）了解由一群学术界人士组成的QUAREP-LiMi组织，
4）听听该组织成员对于PSF测试分享了哪些注意事项？
5）学习如何利用Daybook软件，生成符合ISO 21073的系统半峰全宽报告。
1. 什么是ISO 21073标准？
www.iso.org网站上的ISO 21073标准页面
2019年12月，国际标准化组织（ISO）发布了一套针对共焦显微镜的标准：IOS 21073：2019共焦显微镜-用于生物成像的荧光共焦显微镜的光学数据。它对以下各项给出了定义：分辨率和光学层析能力（4.1节），视场均匀度和中心定位精度（4.2节），共定位精度（4.3节），照明稳定度（4.4节），共焦扫描光学系统的功率和视场数（4.5节）。
2. QUAREP-LiMi是个怎样的组织？
即使上述量的定义再清晰，如果对获取这些量的方式没有清晰的描述，那也是白搭。所有科学家都清楚的一点是：要确保数据的再现性好，按照规定流程操作是关键。
因此，2020年初，一群学术界中饱含热情的光学显微镜专家决定共同撰写一份文档，提供测量方案，来对ISO 21073的内容进行补充，希望借此将光学显微镜的质量评估（QA）和质量控制（QC）水平提升一个台阶。这份文档发表于2020年11月，题为：Interpretation of Confocal ISO 21073: 2019 confocal microscopes: Optical data of fluorescence confocal microscopes for biological imaging – Recommended Methodology for Quality Control。有兴趣的小伙伴们可以自行去搜索这篇文章，没有耐心看长文章的小伙伴们就继续看下面Argolight方面的梳理吧。
《Interpretation of confocal ISO 21073: 2019……Recommended methodology for quality control》一文的题目和作者信息部分
文章的最后他们说道：“很显然，未来我们还需要进行更多的工作来提供最好的测量方法，并对最低限度的QC测试提出建议，还应该将这些方法和测试扩展到其他常用的成像方法中去。”这最终就导致了“光学显微镜中仪器和图像的质量评估和再现性”（Quality Assessment and Reproducibility for Instruments & Images in Light Microscopy，简称QUAREP-LiMi）组织的诞生。虽然这篇文章并不能算作该组织的正式出版物，而且他们的官方正式文件已经蓄势待发，但这些早期建议仍对ISO 21073起到了有效的补充作用。简洁起见，下文将以“QUAREP-LiMi”来指代“现QUAREP-LiMi成员的早期建议”。
Argolight备注：QUARED-LiMi的成员来自世界各地，成员数量已超过200。他们正起草第一份白皮书。有兴趣的小伙伴们可访问http://quarep.org来了解更多。
好了，我们马上进入正文部分：
3. 什么是分辨率？
ISO 21073-2019将分辨率定义为在物镜中心区域测得的共焦PSF的半峰全宽值。横向分辨率即为横向穿过点状物体中心的光强信号的半峰全宽值。而轴向分辨率则是从纵向穿过它的光强信号的半峰全宽值。
4. 应选用何种微球来进行共焦显微镜的PSF测试呢？
微球的尺寸应足够小，以至于它可被视为一个点状结构。ISO 21073和QUAREP-LiMi声称微球应小于物镜/系统的理论分辨率的1/2。
ISO 21073在其附件A中列出了一系列可遵循以下Richards和Wolf公式而计算得到的理论分辨率标准（文献《Richards B., Wolf E., Electromagnetic Diffraction in Optical Systems. II. Structure of the Image Field in an Aplanatic System. Proc. R. Soc. Lond. A Math. Phys. Sci. 1959, 253 pp. 358–379》）。
QUAREP-LiMi表示，对于NA>1.2的高端物镜，为满足这一标准需要使用尺寸小于 100 nm的荧光微球。
Argolight备注：校对本篇文章时，一位专家指出这么小的荧光微球可能无法提供足够的信号，因而建议使用金纳米球而非荧光微球。
QUAREP-LiMi还评论说，要聚焦到这么小的微球中会相当困难。因此他们建议在小微球样品的基础上加入经过大量稀释的大微球（比如尺寸5 μm的微球），以此辅助聚焦过程（当然，该方法不能用于cPSF测量）。
5. 如何固定微球以用于共焦显微镜的PSF测试？
2018年多维荧光显微镜法国技术网络（RT-MFM）及其测量小组发布了一个微球固定方法的分步教学视频，网址在此：https://youtu.be/ll4X_e8_mo8
所准备的微球样品应匹配物镜设计所针对的成像条件：使用/不使用盖玻片，采用与透镜设计相匹配的封固剂。
Argolight备注：校对本篇文章时，一位专家指出，符合上述要求的荧光微球可能让您获得该显微镜和该物镜的最佳分辨率。然而，如果你的目标是确定在生物样本上所能获得的分辨率，你就该使用生物样本实际使用的封固剂。如果PSF测试结果是要用于反卷积算法，情况亦是如此。
RT-MFM视频截图
QUAREP-LiMi和ISO 21073都声称，对于需要使用盖玻片的物镜，最好将微球固定在尽量靠近盖玻片的位置，这样能减少由封固剂造成的像差。
QUAREP-LiMi还强调，为了获得高质量的微球样品，应遵循封固剂要求的干燥时间。与我们交流的其他显微镜专家也同样提到了这点。
6. 如何采集图片以获得共焦PSF？
QUAREP-LiMi建议，拍摄照片时须找到微球所在的焦面，选择微球分布相对稀疏的区域。但是，由于ISO 21073声称分辨率应在物镜中心视场中进行测量，还因为有经验的显微镜专家们推荐测量5-10个cPSF值来获得有意义的值，你应确保在扫描视场的中心区域，微球数量较为合理。
QUAREP-LiMi和ISO 21073都指出，（相机）像素的横向尺寸应至少比（显微系统的）理论分辨率小10倍。QUAREP-LiMi针对工作在520 nm的1.4-1.45 NA的油浸物镜举了例子：假设理论分辨率为160 nm，则（相机）像素的横向尺寸应< 16 nm。
ISO 21073提出扫描视场范围应至少比（显微系统的）理论分辨率大10倍（因此，对于QUAREP-LiMi上述的举例来说，视场应达到1.6 μm）。这一数据针对单个微球。正如QUAREP-LiMi所说，扫描视场应围绕中心点扩大，以确保单幅图像中有足够的微球。
QUAREP-LiMi指出，所用小孔的尺寸至多为1个Airy单位，还需确保计算时使用的波长与图像采集时使用的波长一致。
ISO 21073评论道，如果使用的是非圆形小孔，其最大尺寸应不超过其最小尺寸的50%（比如，方形小孔的对角宽度比其边长大41%）。
光强方面，作为结果的cPSF应能反映出从背景噪声到最亮点的整个动态范围。这能防止对测量结果带来影响。信息通道应为线性的：被激发的荧光和探测器都不应出现饱和。
7. 图像采集时的轴向步进
ISO 21073并未就图像采集时的轴向步进做出推荐。然而，ISO 21073声称：（相机）像素尺寸相比（显微系统的）理论分辨率应足够小，即像素尺寸应至少比理论分辨率小10倍。我们认为这一针对像素尺寸的推荐的含义并不清晰，对它的理解既可能是横向和纵向像素尺寸均应比理论分辨率至少小10倍，也可能是只针对横向像素尺寸的推荐。
问题在于，从实验角度来说，使用这么小的轴向步进，立即就会造成光漂白（如果使用可被漂白的点状光源的话）。
在之前的文章中，QUAREP-LiMi对上述定义采取了第一种理解方式，推荐轴向步进比理论轴向分辨率小10倍。但我们已经注意到，在QUAREP-LiMi当前筹备的文章中，对于轴向步进的推荐已与ISO 21073标准的第一种解读出现偏离，他们推荐了更大的轴向步进。
我们将与ISO标准的作者取得联系，以搞清其有关像素尺寸的本意并澄清满足该要求的条件（读者如对此有兴趣，可联系Argolight方面）。
OK，理论部分至此结束，下面进入实际操作部分。
8. 如何利用Argolight的Daybook 3软件，对微球样品的Z-stack图片进行分析，以获得共焦显微镜的全宽半峰值？
ISO 21073指出，共焦显微镜的全宽半峰值应从未经处理的数据取得（不可使用经过反卷积处理的数据）。应假设以一条宽度仅为一个像素尺寸的曲线从横向和纵向，分别从扫描视场的中心穿过微球，然后对这条曲线进行高斯拟合。
许多软件都可进行这类分析，比如许多基于ImageJ的宏和插件（NoiSee, MetroloJ, ConfocalCheck, AutoQC, PSFj和MIPs）以及一些独立软件/网页应用（Pycalibrate）。以上内容来自QUAREP-LiMi的白皮书。现在Argolight的Daybook软件也已增加了PSF测试项目，它同样遵循ISO 21073的上述原则。用户只需预先利用荧光微球样品拍摄一组Z-stack图片，然后将其上传至Daybook软件，即可获得专业的测试报告。
至此，我们对PSF测试系列活动的报道已经全部结束。希望这些内容都对您有所帮助。共焦显微镜发展至今，一方面，人们已不满足于仅将其用作样品观测的定性工具，对定量、可重复的需求呼之欲出；另一方面，不同系统的性能要进行比较，势必要求人们就参数的定义和参数测量的方式达成共识、形成标准。ISO 21073和QUAREP-LiMi的相继出现，体现了朝着这一方向所做的努力。Argolight通过其包含标准图样的荧光测试标准片和定量分析软件Daybook，无疑也希望推动这一目标的达成。
