荧光显微系统质量评估应用分享第13期：光谱响应以及镜像旋转验证

Argolight荧光定量标准片是专门为荧光显微系统的性能评估、参数验证、校准和监控而设计的。它包含多种二维和三维的荧光图案。

 

本系列文章是针对Argolight荧光定量标准片中的每个荧光图案进行部分应用案例的分享。其中一些应用可以通过Argolight配套的图像处理软件“Daybook”完成，有一些则可以通过人类视觉或其他辅助软件进行分析。具体请联系西诺光学，见文末联系方式。

以下内容将为大家分享Argolight荧光定量标准片中 “ARGOLIGHT” Logo图案用于判断系统是否镜像旋转和验证系统的光谱响应，以及“3D点阵”的案例分享。

“ARGOLIGHT”Logo图案（Argo-LM v2.0，-HM v2.0，-SIM v2.0）

图1 ：Argo-SIM:”ARGOLIGHT”Logo图案由构成公司名称“Argolight”的字母组成，并由80μm×18μm的框架包围。

 

“3D点阵”图案（Argo-SIM v2.0）

图2 ：Argo-SIM:“3D点阵”图案由9×9×9个小圆环组成的3D矩阵，间隔5μm，总体积为40μm×40μm x 40μm。

 

镜像旋转

问题：由于“ARGOLIGHT”标志具有非对称性，因此可用于检查相机或扫描是否相对于显微镜台定向良好，或者在光路中是否存在修改图像的光学镜片。

如果无法在图像中水平读取“ARGOLIGHT”一词，则表示相机或扫描方向错误。

如果图像以镜像方式读取“ARGOLIGHT”一词，则说明光路中存在会使图像发生反转的光学镜片。

光谱响应

问题：荧光显微镜虽然是成像系统，但也可以获得发射光谱，其空间分辨率比常规光谱仪更好，但光谱分辨率较差。

用显微镜检测发射光谱的方式需要了解显微镜系统的光谱响应。

使用校准过的常规光谱仪测量Argolight荧光定量标准片中图案的荧光发射光谱，并将这些“真实”光谱存储在Daybook软件的数据库中。

因此，使用显微镜测量的任何发射光谱都可以通过Daybook与真实光谱进行比较，由此确定显微镜的光谱响应，即测量光谱与真实光谱的比值。

在整个收集光谱窗口中，完美的光谱响应应该是平坦的。

实例：图3显示了使用共聚焦显微镜测量的发射光谱、用已校准的光谱仪测量的真实光谱，以及系统在488 nm激发波长和510-650 nm收集窗口下的光谱响应。

结果表明，系统光谱响应的变化约为20%。这种方法也可用于评估或跟踪荧光滤光片的透过率特性。

图3：488nm激发波长下图案的真实（蓝色）和测量（红色）归一化发射光谱。系统光谱响应（绿色）是实测光谱与真实光谱的比值。

 

3D点阵

实例：该图案于之前分享过的“二维点阵”图案有相似的组成结构，“3D点阵”可以用于评估相同的方面比如场照均匀度等。但体积要大很多，特别是可以用于验证系统的轴向色差和反卷积性能。

图4显示了宽场图像Z-Stack的反卷积。

图5：Argo SIM；在GFP通道上使用63×/1.4平场复消色差油物镜采集的“3D点阵”的宽场图像的Z-Stack的反卷积。颜色编码是指“点”的深度。

使用惠更斯专业软件（www.svi.nl）对图像进行反卷积和（MIP/surface）渲染。

以上是本期关于“ARGOLIGHT” Logo图案用于判断系统是否镜像旋转和验证系统的光谱响应，以及“3D点阵”的案例分享，下周将继续为大家分享一些常见问题。请大家持续关注“Sinoptix”微信公众号。