创新快捷的荧光检测评估方案——以荧光（共聚焦）显微镜分辨率为例

Confocal（激光共聚焦显微镜）现在已经司空见惯，甚至是超分辨（SIM等）也是屡见不鲜，今天我们就定性和定量两个方面分析显微成像系统的性能（以分辨率为例），从而更了解系统性能好坏，才能在选择显微镜时做到有的放矢 。

这次我们主要测试对象为奥林巴斯（Olympus） SpinSR超高转盘共聚焦系统，搭载超分辨模块SpinSR10，配以Photometrics 公司的Prime 95B相机。

一、定性分析

利用共聚焦模块与超分辨模块分别在100倍油镜下扫描，采集成像。样品采用Argolight标准测试片Argo-SIM。此测试片中的图样由激光写入，不仅无光漂白效应，而且常见波段皆可被激发，使用方便。

通过标准测试片中的“间距渐变线对”图样可以快速定性评估系统空间分辨率及信噪比。Argolight的Argo-SIM标准片中共有4组间距渐变线对，分别朝向四个方向，用以测试显微镜对不同方向的分辨率。线对间距以0 nm为起点，30 nm为步进递增至390 nm。

图一：用户在观看“间距渐变线对”图样（激发光488nm ）

 

实时预览状态下，我们仅用肉眼就可以看出，线对之间有无明显分开，以此大致判定系统的分辨率。线对从下往上数，如从第n根可以分开，则显微镜的分辨率大致为（n-1）*30nm左右。以下图为例：

图二 定量分析示意图

但是，人眼判断的精确度有限。对于关注方法学的人，仅仅定性分析已不能满足需求。需要对相关结果定量分析，得出更准确的值。

 

二、定量分析

第二阶段，我们将上述采集到的图像分别送入Argolight测试片配套的图像分析软件Daybook中自动计算出分辨率结果。为了得到更为准确的结  果，分析过程中截取图像不同区域，分别计算出其分辨率，平均计算得出最终分辨率数值。

图三 Daybook软件对比度测量计算图

 

分析过程中，Daybook软件首先自动识别图像中的线对，将强度曲线中的峰值和谷值分别进行标定，之后计算不同线对之间峰值和谷值得的光强对比度（见图三）。另外，软件允许用户选择对比度阈值，以此作为分辨率的判定标准。

 

图四 Argo-SIM测试片中的“间距渐变线对”图样的成像（激发光488 nm）

confocal成像（左） 右：超分辨模块成像（右）

 

图五 Daybook软件测量结果截图

通过此次测试，我们清楚了解该显微镜的实际分辨率，验证了与厂家参数的契合度。同时，有赖于Argolight荧光显微镜测试方案的高效和便捷，整个测试过程耗时不超过30分钟。

Argolight荧光标准评估片除了测试显微镜分辨率外，还可以测试其它性能如照明均匀度、光强光谱响应度、空间共定位、定位误差等等。可关注后续文章或致电了解更多功能。

 

（注）

1、图片传送压缩问题，图片可能失真。烦请谅解！

2、测量最终结果涉及其他厂家相关产品，暂决定不公布相关测量准确数值，如需了解结果可咨询相关厂家。我司仅负责提供相关产品测量方案，不负责具体系统的评测。烦请谅解！